Ģenētiskās slimības joprojām ir globāls izaicinājums, jo tās izraisa gēnu mutācijas, kas ietekmē indivīdu bioloģiskās funkcijas, vielmaiņas procesus vai noteiktu būtisku proteīnu ražošanu līdz dažādiem iedzimtiem traucējumiem. Gēnu terapijas zāles ir terapeitiskas iejaukšanās veids, kas vērsts uz konkrētiem gēniem, kuru mērķis ir tos labot vai modificēt, un sniegt jaunus norādījumus šūnām, lai ražotu funkcionālus proteīnus vai iejauktos gēnu defektos, kas izraisa slimības.
Parastās gēnu zāles galvenokārt ietver DNS un RNS, kur DNS var būt gēnu fragmenti vai gēnu sekvences ar terapeitisku iedarbību. Šīs DNS tiek piegādātas šūnām, lai aizstātu vai papildinātu bojātās vai trūkstošās gēnu funkcijas. RNS var būt ziņojuma RNS (mRNS), maza interferējoša RNS (siRNS) vai antisense oligonukleotīdi (ASO) utt., kurus var izmantot, lai modificētu, kavētu kaitīgo gēnu ekspresiju vai atjaunotu noteiktu gēnu darbību.
Tomēr gan DNS, gan RNS saskaras ar daudzām problēmām, sākot no iekļūšanas cilvēka ķermenī līdz mērķa šūnu sasniegšanai. Tā kā gēnu sekvences kuņģa-zarnu traktā ir nestabilas, tās parasti ievada intravenozas vai subkutānas injekcijas veidā, taču pat tādā gadījumā lielāko daļu gēnu sekvences joprojām noārda cilvēka organismā bagātīgās nukleāzes.
Kad neliels daudzums atlikušo gēnu zāļu nonāk mērķa šūnu ārpusē, tās nevar iekļūt šūnās, jo gēnu sekvences ir lielas molekulas ar fosfātu grupām, kas nes negatīvus lādiņus, savukārt šūnu membrānās ir arī negatīvi lādiņi. Kad satiekas divi negatīvi lādiņi, gēni tiek atgrūsti un nevar iekļūt šūnās. Tāpēc mums ir jāizstrādā specifiskas gēnu zāļu ievadīšanas metodes, lai novērstu to degradāciju in vivo un uzlabotu šūnu membrānas iespiešanās efektivitāti, kā arī vienmērīgi nogādātu šūnās DNS vai RNS sekvences.
Gēnu zāļu piegādes metodes
Pašreizējās izplatītās gēnu piegādes metodes galvenokārt ir iedalītas divās kategorijās: vīrusu vektora piegāde un ne-vīrusu vektora piegāde. Vīrusu vektora piegāde galvenokārt ietver adeno-saistīto vīrusu (AAV) un lentivīrusu utt., kas var simulēt saimniekšūnu vīrusu infekcijas procesu un viegli šķērsot šūnu barjeras, tādējādi panākot augstu piegādes efektivitāti. Tomēr vīrusu vektora piegādei ir arī problēmas: pirmkārt, tam ir ierobežota iepakošanas jauda, piemēram, AAV maksimālā iepakojuma jauda ir 4,7 kb, kas nevar nodrošināt garākas gēnu sekvences; otrkārt, vīrusu vektori var izraisīt nopietnas imūnās reakcijas, tostarp šūnu imunitāti un humorālo imunitāti, radot riskus klīniskai lietošanai. Salīdzinot ar to, ne-vīrusu pārnēsātājiem ir milzīgas priekšrocības attiecībā uz drošību un zāļu iekraušanas kapacitāti.
Pašreizējie plaši izmantotie ne{0}}vīrusu vektori galvenokārt ietver liposomas, polimērus, nanodaļiņas, eksosomas utt., tostarp liposomas ir pūslīši, ko veido amfifilas molekulas ar diametru no 100 nm līdz 1 um. Tie galvenokārt sastāv no fosfolipīdiem, holesterīna, PEG lipīdiem un katjonu lipīdiem. Fosfolipīdu divslāņu struktūra ir līdzīga šūnu membrānām un var netraucēti iekļūt šūnās ar endocitozes palīdzību. Turklāt liposomas var arī modificēt PEG vai specifiskas antivielas uz to virsmām, lai izvairītos no ķermeņa imūnās attīrīšanas, vienlaikus mērķējot uz konkrētiem audiem vai šūnām. Katjonu liposomas ir liposomas, kas satur pozitīvi lādētus kvaternāro amonija sāls lipīdus, kas var labāk saistīties ar negatīvi lādētām nukleīnskābju zālēm un uzturēt piegādes sistēmas stabilitāti. Tāpēc liposomas ir viena no izplatītākajām ne-vīrusu vektoru ievadīšanas metodēm gēnu zālēm.
Tomēr tradicionālajām liposomām ir arī dažas problēmas: pirmkārt, lielā liposomu diametra diapazona dēļ, lai gan tas var nodrošināt pietiekamu zāļu iekraušanas spēju, liposomām izejot cauri asinsvadu endotēlija spraugai (100-200 nm), pārāk liels izmērs kavēs šo procesu. Turklāt pēc liposomu iekļūšanas šūnās ar endocitozes palīdzību un veidojot endosomu-lizosomu sistēmu, tradicionālās liposomas nevar savlaicīgi pabeigt lizosomu izkļūšanu, kā rezultātā lielākā daļa gēnu zāļu tiek noārdītas lizosomās un nespēj iedarboties. Pamatojoties uz šiem tradicionālo liposomu trūkumiem gēnu zāļu piegādē, ir izstrādātas lipīdu nanodaļiņas (LNP) un kļuvušas par svarīgu piegādes metodi, kas īpaši piemērota nukleīnskābju piegādei mērķa šūnās un audos.
Ievads LNP pārvadātāju sistēmā
Lipīdu nanodaļiņas (LNP) ir nanodaļiņas, kas sastāv no lipīdiem{0}}līdzīgām vielām un kuru diametrs parasti ir no 10 līdz 200 nm. Salīdzinot ar tradicionālajām liposomām, tās ir mazākas un vieglāk iziet cauri asinsvadu endotēlija spraugām. Turklāt LNP parasti sastāv no katjonu/jonizējamiem lipīdiem, palīgfosfolipīdiem, polietilēnglikola (PEG) lipīdiem un holesterīna. Tostarp palīgfosfolipīdi un holesterīns var palielināt LNP stabilitāti; PEG lipīdi palīdz palielināt LNP cirkulācijas laiku in vivo un samazina imūnās reakcijas. Šīm sastāvdaļām ir līdzīgas funkcijas kā tradicionālajām liposomām. Atšķirība slēpjas katjonu/jonizējamos lipīdos, kas arī ir galvenā LNP patentaizsardzības joma.
Kā minēts iepriekš, katjonu liposomas var efektīvi uzturēt saistīšanos ar nukleīnskābju zālēm un uzlabot nukleīnskābju zāļu piegādes efektivitāti. Tomēr katjonu liposomas ir pakļautas arī nespecifiskai saistīšanai ar negatīvi lādētiem plazmas proteīniem, asins šūnām utt. ķermeņa cirkulācijā, izraisot liposomu agregāciju un ātri izvadot no ķermeņa (katjonu liposomu pusperiods in vivo ir tikai 15 minūtes).
Lai atrisinātu šo problēmu, pētnieki ir izstrādājuši jauna veida lipīdu materiālu, ko sauc par jonizējamiem lipīdiem. Jonizējamie lipīdi pēc struktūras ir ļoti līdzīgi katjonu lipīdiem. Kā piemērus ņemot parasto katjonu lipīdu DOTAP un jonizējamo lipīdu DODAP, atšķirība ir tāda, ka DOTAP ir ceturtdaļas amonija sāls ar pozitīvu lādiņu, savukārt DODAP ir terciārā amīna struktūra. Terciārā amīna struktūra var uzturēt lipīda pKa no 6 līdz 7. Ja pH ir zemāks par pKa (skābos apstākļos), jonizējamie lipīdi ir pozitīvi uzlādēti.
Ja pH ir tuvu pKa (neitrālos apstākļos), jonizējamie lipīdi ir neitrāli. Šis dizains var gudri atrisināt problēmu, ar ko saskaras katjonu liposomas: tā kā pH līmenis asinsritē ir tuvu neitrālajam, jonizējamie lipīdi arī ir neitrāli, un nespecifiskā saistīšanās starp tiem un plazmas olbaltumvielām vai asins šūnām ir ievērojami samazināta, pagarinot pussabrukšanas periodu. Turklāt, kad šūnas uzņem jonizējamo lipīdu LNP un iekļūst lizosomās, lipīdi tiek jonizēti un pozitīvi uzlādēti lizosomu vidē ar pH 5-6. Pozitīvi lādētie lipīdi tiek viegli sapludināti ar endosomu-lizosomu membrānu, ļaujot liposomām izkļūt citoplazmā, atdalīties un atbrīvot nukleīnskābes, tādējādi iedarbojoties. Rezumējot, LNP nesējsistēmas projektēšana ietver lipīdu sastāva, daļiņu izmēra, virsmas lādiņa un stabilitātes optimizēšanu, lai panāktu efektīvu gēnu piegādi.
LCMS bioanalīzes stratēģija LNP{0}}iepakotajām gēnu zālēm
LNP-iepakotās gēnu zāles galvenokārt sastāv no LNP apvalka un pašas gēnu zāles. LNP apvalks galvenokārt sastāv no lipīdu komponentiem (katjoni/jonizējamie lipīdi veido aptuveni 30-50%, PEG lipīdi veido aptuveni 2%, holesterīns veido apmēram 20-50%, palīgfosfolipīdi veido apmēram 10-20%), savukārt gēnu zāles galvenokārt sastāv no gēnu sekvences fragmentiem (DNS un miRNS, siRNS u.c.). Saskaņā ar jaunākajiem NMPA un FDA noteikumiem[14-15] zāļu ievadīšanas sistēmas zāļu, piemēram, LNP, IND lietošanai, papildus aktīvās sastāvdaļas (gēnu secības) farmakoloģisku un farmakokinētisku pētījumu veikšanai, drošības un farmaceitiskā izvērtēšana ir nepieciešama arī jauniem lipīdu komponentiem, kas nav lietoti tirdzniecībā esošajās medikamentos zāļu ievadīšanas sistēmā, piemēram, katjonu lipīdiem un LNP lipīdiem ar modificētu PEG.
LNP lipīdu LCMS bioanalīze koncentrējas uz katjonu / jonizējamiem lipīdiem un PEG lipīdiem. Strukturālo atšķirību dēļ katjonu/jonizējamo lipīdu molekulmasa parasti ir 1 kDa robežās, savukārt PEG lipīdu molekulmasa pēc modifikāciju grupu pārnēsāšanas var sasniegt 2–5 kDa, kā rezultātā starp tām ir lielas atšķirības hromatogrāfiskajā aizturē un masas spektrometrijas atbildē. Ņemot vērā, ka katjonu/jonizējamā lipīda saturs LNP ir augstāks nekā PEG lipīda saturs, atbildes reakcijas atšķirība noved pie nespējas efektīvi apvienot abu pirmapstrādes metodes (ekstrakcijas šķīdinātāja izvēli, atšķaidīšanas koeficienta noteikšanu). Turklāt, tā kā ap PEG lipīda pīķa pozīciju ir daudz traucējošu pīķu, efektīvai atdalīšanai bieži ir nepieciešams garāks šķidrās fāzes atdalīšanas gradients, kas nevar garantēt augstu analīzes efektivitāti. Tāpēc bioanalīzē mēs atsevišķi izveidojam PEG lipīdu noteikšanas metodi. Tajā pašā laikā katjonu/jonizējamo lipīdu un PEG lipīdam ir arī kopīgas grūtības metožu izstrādē to lipīdu komponentu dēļ, piemēram, slikta šķīdība ūdenī, nestabilitāte bioloģiskajā matricā, proteīnu saistīšanās ar atjaunošanos, pārsniedzot robežu, liels traucējums un PEG lipīda atlikums, lipīda stabilitātes izmaiņas reālā parauga matricā un grūtības iekšējā standarta atlasē.
